Penulenan dan pencirian enzim a-amilase daripada Aspergillus flavus serta amplifikasi cDNA gen a-amilase dengan tindakbalas ra
Loading...
Date
1995-03
Authors
Khoo, Siew Ling
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Aspergillus flavus (Link) menghasilkan lebih kurang 50 U/ml aktiviti
amilolisis apabila dikulturkan dalam medium cecair yang mengandungi kanji ubi kayu
gred rendah sebagai substrat. Analisis secmoa elektroforesis turasan kultur te1ah
mempamerkan kehadiran satu jenis enzim amilase melalui pewarnaan zimogram gel
poliakrilamidao Enzim amilolisis tersebut telah dikenalpastikan sebagai. a-amilase
apabila ia menyebabkan (i) penurunan nilai biru kanji yang pesat dan (ii) penghasilan
satu eampuran hasil hidrolisis kanji yang terdiri daripada glukosa, maltosa,
maltotriosa dan maltotetriosa. a-Amilase tersebut ditulenkan melalui pemendakan
ammonium sulfat dan kromatografi penukaran ion dan didapati bersifat homogen
dalam gel poliakrilamida-sodium dodesil sulfat.
, Enzim a-amilase tulen didapati mempunyai berat molekul di sekitar 53 kD
dengan titik isoelektrik pada pH 3.42. Enzim tersebut menunjukkan aktiviti
maksimum pada pH 6.0 danstabil dalam julat pH 5.0 - 8.5. Suhu optimum enzim
adalah 55°C dengan kestabilan krmaJ selama salU jam sehingga 50uC. Nilai Kill dan
V maks untuk kanji ubi kayu masak adalah 0.5 gil dan 109 umol gula penurun per mg
protein per min. Aktiviti amilase digalakkan oleh ion Ca2
• manakala AgT dan Hg2T
pula merupakan perencat yang mujarab.
eDNA amilase telah diamplitikasikan secara tindakbalas rantai polimerase
dengan menggunakan oligonukleotida penghujung 5' yang mewakiJi jujukan peptida
penghujung-N dan satu kombinasi oligo(dT) dengan tambahan dua bes pada
penghujung 3'nya sebagai primer. Oligo(dT)-oligo(dT) tcrsebut dikumpulkan kepada
3 golongan secara rawak.
Amplifikasi telah dilakukan dengan beberapa suhu penyepuhan primer. Akan
tetapi, keputusan hanya dapat diperhatikan dengan suhu penyepuhan pada 3rc.
Ketiga-tiga golongan memberikan jalur tunggal DNA yang jelas yang mana satu
daripadanya adalah lebih keeil sedikit. Ketiga-tiga jalur terscbut dinyalakan apabila
penghibridan Southern hasil-hasil al11plifikasi dengan jujukan peptida bahagian tengah
dilakukan. Darjah ketegangan penghibridan sudah meneukupi untuk mengelakkan
sebarang pengikatan tak spesifik di mana tiada jalur DNA penanda saiz pOEM yar1g
juga tersekatgerakkan di atas l11embran nylon yang sama dinyalakan. Maka, kita dapat
menyimpulkan bahawa suatu eDNA amilase A . ./Zavus telah dial11plifikasikan.
Memandangkan terdapat pcrbezaan saiz dalam hasil-hasil yang leramplifikasi,
penghibridan Southern DNA ~enom dengan prob oligonukleotida yang mewakili
jujukan peptida bahagian tengah telah dilakukan seem·a berasingan. Beberapa. jalur
telah dinyalakan menunjukkan bahawa kel11ungkinan terdapat lebih daripada satu gen
amilase dalam A. jlavus.
Description
Keywords
Aspergillus flavus menghasilkan lebih kurang 50 U/ml aktiviti amilolisis , apabila dikulturkan dalam medium cecair yang mengandungi kanji ubi kayu gred rendah